Στη διάρκεια μιας από τις σημαντικότερες περιόδους της ευρωπαϊκής ιστορίας, μέσα στη δίνη των Σταυροφοριών, ιδρύεται ένα θρησκευτικό-στρατιωτικό τάγμα ιπποτών που έμελλε να μετατρέψει τη Ρόδο σ’ ένα από τα ακμαιότερα κέντρα της ανατολικής λεκάνης της Μεσογείου. Το απόρθητο φρούριο των Φράγκων ιπποτών, η μεσαιωνική πόλη της Ρόδου, αποτελεί εξαίρετο παράδειγμα αρχιτεκτονικού συνόλου, που καθρεφτίζει με τον πλέον εύγλωττο τρόπο μια πολυτάραχη ιστορία φωτεινών επιτευγμάτων, στοιχειωμένων όμως από την ανασφάλεια και το φόβο επιδρομών και έξωθεν απειλών.
Το Τάγμα των Ιπποτών του Αγ. Ιωάννη της Ιερουσαλήμ, οι περίφημοι Ιωαννίτες Ιππότες, κυριάρχησαν στα Δωδεκάνησα από το 1309 έως το 1522, διάστημα που είναι γνωστό ως Ιπποτοκρατία. Πρώτο και κύριο μέλημά τους, η πρωτεύουσα της Ρόδου και έδρα τους μεταμορφώνεται σε μια οχυρωμένη πόλη ικανή να αντέξει τις σκληρότερες πολιορκίες, όπως αυτή του 1480 από το σουλτάνο Μωάμεθ Β΄, τον πορθητή της Κωνσταντινούπολης. Με το Παλάτι του Μεγάλου Μαγίστρου, το μεγάλο νοσοκομείο του Τάγματος (σημ. Αρχαιολογικό Μουσείο της Ρόδου) και την Οδό των Ιπποτών, η Άνω Πόλη αποτελεί ένα από τα ωραιότερα σωζόμενα αστικά σύνολα της γοτθικής περιόδου. Παράλληλα, στην Κάτω Πόλη, τα δυτικότροπα μεσαιωνικά μνημεία συνυπάρχουν με τις προγενέστερές τους βυζαντινές εκκλησίες, αλλά και τα μεταγενέστερά τους οθωμανικά τζαμιά, δημόσια λουτρά και άλλα κτίρια της Τουρκοκρατίας. Αυτό το χαρμάνι δυτικών και ανατολικών επιδράσεων, ζυμωμένο με την ντόπια παράδοση που ουδέποτε διέρρηξε τους δεσμούς της με το βυζαντινό και το απώτερο αρχαίο παρελθόν της, καθιστούν την παλιά πόλη της Ρόδου ένα μοναδικό σταυροδρόμι πολιτισμών.
Η μεσαιωνική πόλη περικλείεται από ένα τείχος με συνολικό μήκος 4 χλμ., που ακολουθεί την πορεία του βυζαντινού τείχους, πάνω στο οποίο και θεμελιώθηκε. Ένα δεύτερο, εσωτερικό αυτή τη φορά τείχος, χωρίζει την πόλη στα δύο, προσδίδοντάς της τυπική μορφή δυτικοευρωπαϊκού αστικού κέντρου της εποχής: στο βόρειο τμήμα βρισκόταν η άνω πόλη ή Collachium, όπου διέμεναν τα μέλη του τάγματος και όπου στεγάζονταν οι διοικητικές λειτουργίες, ενώ το νότιο τμήμα ή burgus αποτελούσε τον πυρήνα της κατοίκησης, καθώς και το εμπορικό και οικονομικό εν γένει κέντρο της πόλης, που ο πληθυσμός της στα 1522 ανερχόταν σε 5.000 κατοίκους.
Όσο κι αν ήταν ισχυρά, όμως, τα τείχη της Ρόδου δεν άντεξαν στο πυροβολικό των Οθωμανών. Από τα τελευταία αναχώματα της σταυροφορικής Δύσης, η Ρόδος έπεσε τελικά στα χέρια του Σουλεϊμάν Β΄ στις αρχές του 1523, μετά από εξάμηνη πολιορκία. Την Τουρκοκρατία ακολούθησε η Ιταλοκρατία έως το 1947, οπότε η Ρόδος και τα υπόλοιπα Δωδεκάνησα ενώθηκαν με την Ελλάδα.